Método: Digestión por enzimas de restricción

Introducción

Las endonucleasas o enzimas de restricción son proteínas de origen bacteriano que reconocen y cortan secuencias específicas de ADN de doble cadena. Estas enzimas se pueden clasificar en tres grupos del I al III. Las enzimas tipos I y III tienen la capacidad de metilar y cortar el ADN, mientras que las del tipo II solo cortan el ADN. Los microbiólogos suizos Werner Arber y Stuart Linn descubrieron las enzimas de restricción en la bacteria E. coli, haciendo acreedor a Werner Arber al Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1978 junto con Daniel Nathans y Hamilton O. Smith “por descubrir las enzimas de restricción y sus aplicaciones en problemas de la genética molecular”. Arber observó las enzimas de restricción mientras estudiaba un fenómeno conocido como restricción del bacteriófagos que era controlada por el hospedero. Antes del trabajo de Arber, los investigadores Salvador Luria y Mary Human habían demostrado que varios fagos que eran específicos para su hospedero, sobrevivían y se replicaban, pero crecían pobremente en otras cepas. Se decía que esos fagos que crecen pobremente eran “restringidos” por su hospedero (Luria y Human, 1952).

Arber y Linn propusieron que las células bacterianas debían protegerse contra el ADN extraño mediante un mecanismo de defensa enzimático (Arber & Linn, 1969). Además teorizaron que solo aquellos bacteriófagos que habían estado previamente en contacto con una cepa bacteriana podrían infectar con éxito a nuevas células hospederas de la misma cepa. Propucieron que, la exposición previa de la cepa al bacteriofago de alguna manera modificaba su ADN protegiéndose de la restricción. Por otro lado, los fagos que no modificaban su ADN, era degradado por las enzimas. Se propuso además, que habían sitios específicos en el genoma con mayor actividad de restricción. Arber y Linn llamaron a la enzima responsable de este “corte nucleolítico” como endonucleasa R. Este nombre más tarde cambió a EcoB, no pasó mucho tiempo para que otros científicos identificaran la siguiente enzima de restricción en E. coli : la EcoK (Meselson & Yuan, 1968).

Posterior al descubrimiento de EcoB y EcoK, los investigadores Hamilton O. Smith y Kent Wilcox aislaron y caracterizaron la primera enzima de restricción de una especie bacteriana diferente: Haemophilus influenzae, HindII. Además, confirmaron la hipótesis de Arber y Linn al demostrar que HindII, degrada el ADN del fago pero no el ADN del hospedero bacteriano (Smith y Wilcox, 1970). Más tarde Smith y Thomas Kelly, identificaron el nucleótido de la secuencia del sitio específico donde HindII corta, confirmando nuevamente la hipótesis de Arber de que las enzimas de restricción son extremadamente específicos con respecto al corte de la enzima (Smith & Kelly, 1970).

La primera aplicación de las enzimas de restricción fué en un estudio realizado por el bioquímico de Daniel Nathans Johns Hopkins  y su estudiante Kathleen Danna (Danna & Nathans, 1971). Utilizando los mismos métodos experimentales de Smith y Wilcox para purificar HindII, realizaron cortes en el ADN del virus SV40 resultando 11 fragmentos lineales únicos. Finalmente, separaron los fragmentos usando geles de electroforesis y desde entonces los científicos han aislado más de 3600 enzimas de restricción diferentes en 230 especies bacterias (depositadas en: REBASE) (Roberts RJ, et al 2007). La mayoría de los sitios de corte de las enzimas de restricción tienen una longitud de 4 a 6 bases, y la mayoría son palindrómicos, lo que significa que la secuencia se puede leer igual hacia adelante y hacia atrás. Por ejemplo: HindIII, es una enzima de restricción que reconoce la secuencia 5’AAGCTT-3 ‘(cadena superior) / 3’TTCGAA-5’ (cadena inferior) y corta entre las dos A en ambas cadenas.

Material

1. Tubos de 1.5 mL
2. Guantes de nitrilo o latex
3. Micropipetas
4. Puntas de 1000, 200 y 20 µL
5. Gradilla para tubos
6. Termomixer

Reactivos

1. ADN (genómico, plásmido, producto de PCR)
2. Enzimas de restricción
3. Buffer de la enzima
4. Buffer EDTA 0.5M a pH 8.0

Procedimiento

Para digerir entre 0.1 a 1 µg de ADN en un volumen final de 20 µL se deben seguir los siguientes pasos:

1. Tomar el ADN: genómico, plásmido o producto de PCR a digerir y llevar a un volumen total de 20 µL con agua ultrapura y esteril. NOTA: el fragmento a cortar debe estar flanqueado por al menos 6 bases nitrogenadas. 
2. Adicionar 2 µL del buffer apropiado (buffers 10 X: Buffers para Enzimas de restricción)
3. Agregar 1 µL de la enzima seleccionada. Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir 1 mg de ADN en una hora.
4. Incubar la reacción a la temperatura adecuada (sugerida por el proveedor) por 1-2 horas.
5. La digestión se detiene incubando a una temperatura entre 75 – 80 °C por 15 min. y/o adicionando 0.5 M de EDTA (pH 8.0) a una concentración final de 10 mM.

NOTA: Cada enzima de restricción requiere de condiciones óptimas para su funcionamiento, usualmente las condiciones las especifica el fabricante. Las variables más importantes suelen ser el tiempo, la temperatura de incubación y la composición de las disoluciones buffers de la reacción.